2.2不同干燥方式蛋清蛋白的外观和色泽分析

如图2所示，EWP-P为细腻的鹅黄色颗粒粉末，EWP-D为松散的黄色片状物。EWP-P的L*、a*和b*值分别为53.90±0.23、−2.06±0.70和6.04±0.21。EWP-D的L*、a*和b*值分别为49.89±0.36、−1.65±0.26和3.84±0.50（表1）。EWP-P的b*值较大是因为蛋清蛋白中的葡萄糖在喷雾干燥过程中与蛋白发生了美拉德反应。此外，真空冷冻干燥需将样品进行冷冻预处理，冷冻过程中，蛋清蛋白会发生褐变反应，故EWP-D最终呈现出的颜色较EWP-P黄（图2）。EWP-P的颜色较EWP-D白（图2），可能是因为干热喷雾干燥的干燥速度快，蛋清中的蛋白质受热时间短。因此在本实验干燥条件下，干热喷雾干燥所得的蛋清蛋白粉更亮、更白，易被消费者接受。

2.3不同干燥方式蛋清蛋白的内源性荧光分析

蛋白质的固有荧光来自于内部的芳香族氨基残基（酪氨酸Tyr、色氨酸Trp、苯丙氨酸Phe），其荧光最大值（λmax）、强度对其微环境的极性极其敏感，因此可用来表征蛋白质的三级结构变化，其中Trp、Tyr和Phe的特有荧光激发波长分别为295、275和258 nm。如图3所示，与EWP-C相比，不同干燥方式制备的蛋清粉的固有荧光强度降低但荧光峰的位置未有明显的迁移。EWP-P的荧光强度低于EWP-D于EWP-C，可能是因为喷雾干燥的干燥温度高，蛋清蛋白变性程度大，芳香族氨基酸残基暴露于更极性环境中，进而发生了荧光猝灭现象。此外，EWP-P的荧光强度较低还可能是由于蛋清蛋白中含有葡萄糖，在高温下会与蛋白质发生美拉德反应，屏蔽了芳香族氨基残基。

图3蛋清液及不同干燥方式EWP的内源性荧光

2.4游离巯基和表面疏水性分析

总游离巯基包含蛋白质分子内部和表面的游离巯基。巯基的变化会影响蛋白质的结构和功能，如溶解度、乳化性和胶凝性能等。如图4所示，EWP-C、EWP-P和EWP-D的总游离巯基分别是103.81±2.10、93.40±5.93和113.61±7.63µmol/L，其游离巯基分别是41.96±8.31、56.18±2.88和45.39±1.97。与EWP-C相比，EWP-P表面游离巯基含量显著升高（P<0.05）、总游离巯基含量显著降低（P<0.05）。而EWP-D与EWP-C相比总巯基和表面游离巯基含量差异不显著（P>0.05）。这可能与喷雾干燥过程中卵清蛋白的变性有关，天然状态的卵清蛋白中含有埋藏于球状分子内部的游离巯基，而高温破坏了卵清蛋白的空间结构使内部巯基暴露在蛋白表面。三种蛋清蛋白的表面疏水性与表面游离巯基含量变化趋势一致，EWP-C和EWP-D的表面疏水性差异不显著（P>0.05），但其表面疏水性显著低于EWP-P组（P<0.05），这可能也与喷雾干燥的高温环境有关，该环境下蛋清蛋白部分展开，导致内部疏水基团暴露，从而表面疏水性增高。代晓凝等将自然发酵后的蛋清液分别进行冷冻、热风和喷雾干燥处理，比较三种蛋清粉与溴酚蓝的结合率从而判断其表面疏水性大小为：冷冻干燥>喷雾干燥>热风干燥，推测是喷雾干燥发生美拉德反应引入亲属基团所致。这与本文研究不一致，可能是因为蛋清前处理不同，自然发酵时微生物可能会改变蛋清蛋白的结构。

图4不同干燥方式蛋清粉的总游离巯基（TSH）、表面游离巯基（SH）和表面疏水性（H0）

注：相同指标不同字母上标表示差异显著（P<0.05）。

2.5傅里叶变换红外光谱分析

不同干燥方式蛋清蛋白的红外光谱如图5所示。EWP-P和EWP-D在酰胺A带（3700~3200 cm−1）处有强吸收峰，EWP-P的峰强大于EWP-D，表明干燥方式会影响蛋清蛋白的水合能力，这可能与蛋白质分子中N-H键舒展并与氢键形成了缔合体，或蛋白质分子与葡萄糖以共价键结合有关。酰胺B带（2961.64 cm−1）的弱吸收峰主要由C-N键产生。酰胺I带（1600~1700 cm−1）信号主要由C-O键伸缩振动引起，与蛋白质的二级结构有关，涉及β-折叠（1600~1640 cm−1）、无规则卷曲（1640~1650 cm−1）、α-螺旋（1650~1660 cm−1）和β-转角（1660~1700 cm−1）。采用Peak fit软件对不同干燥方式蛋清蛋白的酰胺I带峰强进行高斯曲线拟合分析，根据峰面积计算其二级结构的相对百分含量，结果如表2。EWP-P和EWP-D的二级结构以β-折叠和β-转角为主，EWP-P的β-折叠含量增加主要与卵转铁蛋白热变性有关，同时分子间的β-折叠结构也易转变为β-转角结构。而α-螺旋下降可能是因为热变性导致α-螺旋中的氢键断裂，进而发生了解螺旋现象。EWP-P无规则卷曲增加，表明其部分有序结构向无规则卷曲转化，蛋白变性明显，结构的随机性增强。

2.6不同干燥方式蛋清蛋白的溶解度分析

溶解性是蛋白重要的功能特性之一，与接触角、表面张力、乳化性等密切相关。如图6A，不同pH下不同干燥方式的蛋清粉溶解度的测量。EWP-P的溶解度随着pH的升高先减小后增大，这可能是因为在酸性和碱性环境中球状蛋白质会发生部分展开，形成熔融球状构象，变得更加灵活，更容易与水分子作用。pH为6.0时蛋清蛋白的溶解度最低，可能是因为该pH与蛋清蛋白中大部分蛋白的等电点相近，蛋白带电荷量较少，因此容易发生沉淀。与EWP-P相比，EWP-D在pH6.0时溶解度的下降程度较小，这可能与真空冷冻干燥后蛋清蛋白的微观结构呈片状，具有较大的比表面积有关，也可能是因为冷冻干燥蛋白质在脱水过程中蛋白质变性低，促进了可溶性聚集物生成。EWP-D的溶解度远大于EWP-P，这是因为喷雾干燥是直接将蛋清液雾化后再干燥，其蛋清粉表面会形成一个光滑、抗湿性的薄膜，最终导致蛋白的溶解性降低，复水性差且易结块。而真空冷冻干燥经过冷冻升华，可保持食品原有的形状故具有很好的速溶性和复水性。Shaviklo等也发现喷雾干燥的含添加剂（花粉）蛋白的蛋白质溶解度明显低于冻干蛋白。

图6不同干燥方式蛋清粉的功能性质

2.7不同干燥方式蛋清蛋白的接触角分析

接触角值作为时间函数的变化，表征了润湿行为，是评价粉体润湿性的常用指标。当样品的接触角大于90°时，表明其疏水性较强，反之则亲水性较强。不同干燥方式制备的蛋清蛋白粉与水相的接触角如图6B所示，EWP-P在0 s时的接触角为99.62°，表现出疏水性特征；EWP-D的接触角为65.97°，表明其具有较好的亲水性。样品与水滴接触60 s后，由于水进入到了粉末内部，两种样品的接触角不断减小，EWP-P的接触角下降到97.07°，EWP-D的接触角下降到59.59°，EWP-D在60 s内接触角的下降速率更大，表明其具有更好的润湿性，这可能与干燥后粉末的微观结构有关。冉乐童等利用扫描电镜观察了冷冻干燥与喷雾干燥蛋清蛋白粉的微观结构，发现EWP-P粉末是球状带孔的结构，且粒径较小，而EWP-D则呈现出较大、松散的片状结构。相较于EWP-P的球状结构，EWP-D的松散片状结构可能更有利于水分在其内部的自由流动，因此具有更好的润湿性。